規格:100 管/96 樣
苯丙氨酸解氨酶(e Phenylalnine ammonialyase , PAL )試劑盒說明書
微量法
正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義
PAL(EC4.3 1 5)廣泛存在于各種植物和少數微生物中,是植物體內苯丙烷類代謝的關鍵
酶,與一些重要的次生物質如木質素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等合成密切相關,在植物正常生長發育和抵御病菌侵害過程中起重要作用。
測定原理
PAL催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸和氨,反式肉桂酸在290nm處有最大吸收值,通過測
定吸光值升高速率計算PAL活性。
所需的儀器和用品
紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔
板(UV板)、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。
試劑一:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存;臨用前加入4mL 蒸餾水充分溶解待用;用不完的試劑 4℃
保存一周;
試劑三:液體 1mL×1 瓶,4℃保存。
粗酶液提取
按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL
提取液),進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至290nm,蒸餾水調零。
PAL 活性計算
用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1) 按蛋白濃度計算
單位定義:每mg組織蛋白在每mL反應體系中每min使290nm下吸光值變化0.1為一個酶活性單
位。
PAL(U/mg prot)=ΔA×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷0.1÷T =13.3×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算
單位定義:每g組織在每mL反應體系中每min使290nm下吸光值變化0.1為一個酶活性單位。
PAL(U/g 鮮重)=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.1÷T =13.3×ΔA÷W
V 反總:反應體系總體積,0.2mL;V 樣:加入樣本體積,0.005mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g。
用 96 孔板測定的計算公式如下
(1) 按蛋白濃度計算
單位定義:每mg組織蛋白在每mL反應體系中每min使290nm下吸光值變化0.05為一個酶活性單位。PAL(U/mg prot)=ΔA×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷0.05÷T =26.6×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算單位定義:每g組織在每mL反應體系中每min使290nm下吸光值變化0.05為一個酶活性單位。PAL(U/g 鮮重)=ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.05÷T =26.6×ΔA÷W
V 反總:反應體系總體積,0.2mL; V 樣:加入樣本體積,0.005mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,30 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g。