HEPENGBIO 組織糖原磷酸化酶 a 活性酶連續循環比色法定量檢測試劑盒
產品說明書
 
主要用途
 
HEPENGBIO 組織糖原磷酸化酶 a 活性酶連續循環比色法定量檢測試劑是一種旨在通過糖原磷酸化酶 a 、 磷酸葡萄糖變位酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶連續反應系統中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP) 還原后峰值的增高，即采用比色法來測定組織裂解萃取樣品中酶活性的方法。其適用于各種組織裂解萃取懸液樣品 (動物、人體、 昆蟲等) 糖原磷酸化 酶 a 的特異活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。
技術背景
 
糖原磷酸化酶 (glycogen phosphorylase；EC2.4. 1. 1) 是磷酸化酶家屬之一，在機體糖原分解 (glycogenolysis ) 利用上發揮重要作用。其結構為同源雙體，有兩種組合形式：緊密型 (tense) 和松弛型 (relaxed) 。處于緊 密型的酶與糖原結合，增強活性。未經修飾的酶 (糖原磷酸化酶b) 催化產生足夠的葡萄糖- 1-磷酸，進入  糖酵解循環，生成ATP 。糖原磷酸化酶催化糖原上α  (1→4) 糖苷鏈 (glycosidic linkage) 的磷酸分解       (phosphorolytic cleavage) 反應，釋放葡萄糖- 1-磷酸產物。糖原磷酸化酶在肝組織、肌肉組織和腦組織中 有不同類型的異構體。糖原磷酸化酶分為a型和b型：a型為活化狀態，而b型為非活化狀態，在單磷酸腺苷  (AMP) 的激活下，轉化為a型。糖原磷酸化酶的缺失將導致肌肉營養不良癥 (McArdle綜合征) 和肝磷酸 化酶缺乏癥 (Hers病) 。基于底物糖原 (glycogen)，在糖原磷酸化酶無需AMP激活劑的存在， 由糖原磷酸 化酶a催化其分解并產生葡萄糖- 1-磷酸 ( α-D-Glucose- 1-Phosphate ) 產物后，通過磷酸葡萄糖變位酶        (phosphoglucomutase；PGLUM) 和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (glucose-6-phosphate dehydrogenase；G-6-PDH) 反應系統，測定氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP) (oxidized nicotinamide adenine dinucleotide        phosphate ；NADP) 轉化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (reduced nicotinamide adenine dinucleotide               phosphate ；NADPH) 所產生的吸光峰值的變化 (340nm  波長) ，來定量分析糖原磷酸化酶a 的特異活性。 糖原磷酸化酶a酶連續循環反應系統為：
 
glycogen phosphorylase a
(glycogen) n       +    Pi               →       (glycogen) n－1    +    α-D-Glucose- 1-Phosphate
 
phosphoglucomutase
α-D-Glucose- 1-Phosphate                   →     α-D-Glucose-6-Phosphate
 
glucose-6-phosphate dehydrogenase
α-D-Glucose-6-Phosphate    +    β-NADP    →  6-Phosphogluconate      +    β-NADPH
(低吸收峰)                               (高吸收峰)
 
產品內容

HEPENGBIO 清理液 (Reagent A)                                          30 毫升
HEPENGBIO 裂解液 (Reagent B)                                           6 毫升
HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C)                                          10 毫升
HEPENGBIO 底色液 (Reagent D)                                           1 毫升
HEPENGBIO 反應液 (Reagent E)                                           1 毫升
HEPENGBIO 陰性液 (Reagent F)                                         500 微升
產品說明書                                                            1 份
 
保存方式
 
保存 HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C)、HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 和 HEPENGBIO 反應液  (Reagent E) 在－20℃冰箱里；  其余的保存在 4℃冰箱里，HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 和     HEPENGBIO 反應液 (Reagent E) 避免光照；有效保證 6 月
 
用戶自備
 
1.5 毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15 毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
(微型) 臺式離心機：用于樣品制備
比色皿或 96 孔板：用于比色的容器
分光光度儀或酶標儀：用于比色分析
 
實驗步驟
 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 HEPENGBIO 裂解液 (Reagent B) 置入冰槽里融化。然后 進行下列操作。
 
一、  樣品準備
 
1 ．  手術取出動物組織，并秤重以確定組織重量
2 ．   (選擇步驟) 放進預冷的 15 毫升錐形離心管
3 ．   (選擇步驟) 加入適量的 (500 毫克組織需要 3 毫升) HEPENGBIO 清理液 (Reagent A) 清洗 1 次
4 ．  移入到一個液氮凍存管
5 ．  即刻放進液氮罐過夜
6 ．  次日從液氮罐里取出，即刻 (最快速度) 用研磨棒碾碎組織成粉末狀 (注意：切莫使組織凍融)
7 ．  放進一個 15 毫升錐形離心管
8 ．  加入置于冰槽里的 500 微升 HEPENGBIO 裂解液 (Reagent B)
9 ．  轉移到 1.5 毫升離心管
10．強力渦旋震蕩 30 秒，充分混勻
11．放進冰槽里孵育30 分鐘，期間每 10 分鐘強力渦旋震蕩 30 秒 (注意：如需暫時停止，放進－70℃冰箱 里儲存備用)
12．即刻放進 4℃微型臺式離心機離心 10 分鐘，速度為 16000g   (或 13000RPM。例如 EPPENDORF 5415)
13．小心移取上清液到新的 1.5 毫升離心管
14．移取 10 微升進行蛋白定量檢測 (注意：建議使用HEPENGBIO Bradford  蛋白質濃度定量試劑盒

)
15．放進－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二、  測定準備
 
1 ．  開啟并設定好分光光度儀 (溫度為 30℃)：波長 340nm ，間隔 60 秒，讀數 6 次 (共 5 分鐘)，并置零
2 ．  從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 避免光照
3 ．  HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C) 室溫下均衡溫度
 
三、  背景對照測定
 
1 ．  移取 780 微升 HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C) 到新的比色皿
2 ．  加入 100 微升 HEPENGBIO 底色液 (Reagent D)
4 ．  加入 100 微升 HEPENGBIO 反應液 (Reagent E)
5 ．  上下傾倒數次，混勻
6 ．  在 30℃溫度下孵育 3 分鐘
7 ．  加入 20 微升 HEPENGBIO 陰性液 (Reagent F)
8 ．  上下傾倒數次，混勻 (限定在 3 秒之內)
9 ．  即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照 (5 分鐘讀數－0 分鐘讀數)
 
四、  樣品測定
 
1 ．  移取 780 微升 HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C) 到新的比色皿
2 ．  加入 100 微升 HEPENGBIO 底色液 (Reagent D)
3 ．  加入 100 微升 HEPENGBIO 反應液 (Reagent E)
4 ．  上下傾倒數次，混勻
5 ．  在 30℃溫度下孵育 3 分鐘
6 ．  加入 20 微升待測樣品 (100 微克蛋白) (注意：樣品須清澈，且pH  為6.8)
7 ．  上下傾倒數次，混勻 (限定在 3 秒之內)
8 ．  即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數 (5 分鐘讀數－0 分鐘讀數)
 
五、  計算樣品活性
 
[  (樣品讀數－背景讀數) X 1  (體系容量；毫升) X 樣品稀釋倍數]÷ [0.02  (樣品容量；毫升) X 6.22  (毫摩 爾吸光系數) X 5  (反應時間；分鐘) ] ＝單位/毫升÷  (樣品蛋白濃度) 毫克/毫升＝單位/毫克
 
單位＝微摩爾 NADP/分鐘
 
六、  酶標儀測定
 
1 ．  在 96 孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
2 ．  分別移取 195 微升 HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C) 到所有孔里
3 ．  分別加入 25 微升 HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 到所有孔里
4 ．  分別加入 25 微升 HEPENGBIO 反應液 (Reagent E) 到所有孔里
5 ．  輕輕搖動 96 孔板

6 ．  在 30℃溫度下孵育 3 分鐘
7 ．  分別加入 5 微升 HEPENGBIO 陰性液 (Reagent F) 或待測樣品 (100 微克蛋白) (注意：樣品須清 澈，且pH  為6.8) 到相應孔里
8 ．  輕輕搖動 96 孔板
9 ．  即刻放進酶標儀檢測，包括 0 分鐘讀數和 5 分鐘讀數)
10．活性計算
 
[  (樣品讀數－背景讀數) X 樣品稀釋倍數 X 0.25  (體系容量；毫升) ]÷ [0.005  (樣品容量；毫升) X 6.22  (毫摩爾吸光系數) X 0.6  (光徑距離；厘米) X 5  (反應時間；分鐘) ] ＝單位/毫升÷  (樣品蛋白濃度) 毫 克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾 NADP/分鐘
 
注意事項
 
1 ．  本產品為 10 次 (比色皿) 和 40 次 (酶標儀) 操作，包括背景對照
2 ．  操作時，須戴手套
3 ．  系統操作過程中，背景測定只需 1 次
4 ．  建議使用比色皿測定
5 ．  樣品須澄清，至關重要
6 ．  加樣后3 秒內比色測定
7 ．  測定值由低到高變化；測定可持續 5 分鐘
8 ．  比色測定后，比色皿須清洗徹底
9 ．  樣本測定 5 分鐘讀數高于 0 分鐘讀數表明具有酶活性
10．建議待測樣本蛋白濃度為 100 微克/20 微升；如果樣本酶活性過低或過高，  則可以增加或降低樣本量 (本公司提供  Bradford 蛋白質濃度定量試劑盒－ )
11．如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
12．糖原磷酸化酶 a 單位活性定義為：在 30℃，pH 6.8 條件下，每分鐘內能夠轉化 1 微摩爾糖原和正磷酸 (orthophosphate ) 至葡萄糖- 1-磷酸所需的酶量作為一個活性單位
13．本公司提供系列細胞磷酸化酶學檢測試劑產品
 
質量標準
 
1 ．  本產品經鑒定性能穩定
2 ．  本產品經鑒定檢測敏感