細胞醛糖還原酶（aldose reductase；AR）活性光度法定量檢測試劑盒
產品說明書
主要用途
HEPENGBIO細胞醛糖還原酶（aldose reductase；AR）活性光度法定量檢測試劑是一種旨在通過底物葡糖醛酸，在醛糖還原酶的催化作用下，產生山梨醇，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用光度法來測定樣品中酶活性的方法。其適用于各種細胞（動物、人體、昆蟲等）裂解懸液樣品醛糖還原酶的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。
技術背景
醛糖還原酶（aldose reductase；ALR2，EC1.1.1.21）是一種NADPH依賴性氧化還原酶，屬于醛酮還原酶（aldo-keto reductase；AKR）超級家族成員之一，催化各種醛類和羰基化合物的還原反應，特別是葡萄糖還原為山梨醇的反應，是葡萄糖代謝中多元醇（polyols）通路的第一步反應的關鍵限速酶。醛糖還原酶主要在人體肝組織、晶狀體、視網膜、雪旺氏細胞、胎盤組織和紅細胞中表達。醛糖還原酶與糖尿病并發癥相關，包括白內障、神經病變、腎臟病變、視網膜病變、動脈粥樣硬化等，由此成為藥物靶標。基于底物葡糖醛酸（glucuronate），在醛糖還原酶的催化作用下，產生山梨醇（sorbitol），同時其輔酶因子還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADPH）轉化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；β-NADP），通過測定吸光值的變化（340nm 波長），來定量分析醛糖還原酶的活性。其反應系統為：
 
    ALR2
Glucuronate  +  β-NADPH  →   sorbitol  +  β-NADP  
 
產品內容
 
HEPENGBIO清理液（Reagent A） 120毫升
HEPENGBIO裂解液（Reagent B）  10毫升
HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）  20毫升
HEPENGBIO反應液（Reagent D）   2毫升
HEPENGBIO底物液（Reagent E）   2毫升
HEPENGBIO陰性液（Reagent F）  500微升
產品說明書      1份
 
保存方式
 
保存在－20℃冰箱里；HEPENGBIO反應液（Reagent D）和HEPENGBIO底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月
 
 
用戶自備
 
1.5毫升離心管：用于樣品制備和保存的容器
15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
細胞刮脫棒：用于細胞脫離
（微型）臺式離心機：用于樣品操作
比色皿或96孔板：用于光度的容器
分光光度儀或酶標儀：用于樣品光度分析
 
實驗步驟
 
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的HEPENGBIO裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進行下列操作。
 
一、 樣品準備
 
1． 準備好75cm2細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 107細胞）
2． 小心加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用胰酶消化）
5． 加入3毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A），混勻細胞
6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入500微升HEPENGBIO裂解液（Reagent B），充分混勻
10． 轉移到預冷的1.5毫升離心管
11． 強力渦旋震蕩15秒
12． 置于冰槽里孵育30分鐘
13． 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
15． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用HEPENGBIO Bradford蛋白質濃度定量試劑盒）
16． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作
 
二、 測定準備
 
1． 開啟并設定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長340nm，間隔2分鐘，讀數6次（共10分鐘），并置零
2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；HEPENGBIO底物液（Reagent E）避免光照
3． HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
 
三、 背景對照測定
 
1． 移取750微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入100微升HEPENGBIO反應液（Reagent D）
3． 加入100微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 上下傾倒數次，混勻
5． 在25℃溫度下孵育3分鐘
6． 加入50微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）
7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數－10分鐘讀數）
 
四、 樣品測定
 
1． 移取750微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入100微升HEPENGBIO反應液（Reagent D）
3． 加入100微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
4． 上下傾倒數次，混勻
5． 在25℃溫度下孵育3分鐘
6． 加入50微升待測樣品（100微克蛋白）（注意：樣品須清澈）
7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
8． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品讀數（0分鐘讀數－10分鐘讀數）
 
五、計算樣品活性
 
[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 1（體系容量；毫升）]÷[0.05（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 1（光徑距離；厘米）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克 
 
單位＝微摩爾NADPH/分鐘
 
六、 酶標儀測定
 
1． 在96孔板上做好相應標記：背景對照和樣品
2． 分別移取150微升HEPENGBIO緩沖液（Reagent C）到96孔板里
3． 分別加入20微升HEPENGBIO反應液（Reagent D）
4． 分別加入20微升HEPENGBIO底物液（Reagent E）
5． 輕輕搖動96孔板
6． 在25℃溫度下孵育3分鐘
7． 分別加入10微升HEPENGBIO陰性液（Reagent F）或待測樣品（50微克蛋白）到相應孔里（注意：樣品須清澈）
8． 輕輕搖動96孔板
9． 即刻放進酶標儀檢測：獲得0分鐘和10分鐘讀數
10． 活性計算
 
[（樣品讀數－背景讀數）X樣品稀釋倍數X 0.20（體系容量；毫升）]÷[0.01（樣品容量；毫升）X 6.22（毫摩爾吸光系數）X 0.6（光徑距離；厘米）X 10（反應時間；分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克 
 
單位＝微摩爾NADPH/分鐘
 
注意事項
 
1． 本產品為20次（比色皿）和100次（96孔板）操作，包括背景對照
2． 操作時，須戴手套
3． 系統操作過程中，背景測定只需1次
4． 樣品須澄清，至關重要 
5． 孵育完成后即刻光度測定
6． 測定值由高到低變化；測定持續10分鐘
7． 樣本測定10分鐘讀數低于0分鐘讀數表明具有酶活性
8． 光度測定后，比色皿須清洗徹底
9． 建議待測樣本蛋白濃度為100微克/50微升（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白質濃度定量試劑盒）
10． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
11． 醛糖還原酶單位活性定義為：在25℃，pH 6.2條件下，每分鐘內能夠轉化1微摩爾葡糖醛酸至山梨醇所需的酶量作為一個活性單位
12． 本公司提供系列醫學生化經典分析試劑產品
 
質量標準
 
1． 本產品經鑒定性能穩定
2． 本產品經鑒定檢測敏感