精子(spermatozoa)分析提供了精子生成(spermatogenesis)、精子壽命、以及生育能力的基礎(chǔ)信息。其中精子的活力(vitality)、運動能力(motility)、授精潛力(fertilizing potential)、膜結(jié)構(gòu)或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性(integrity)、頂體反應(acrosomal reaction)功能的評價是精子分析的重要指標,也是決定人工受孕或體外授精(in vitro fertilization;IVF)的重要參數(shù)。其中質(zhì)膜完整性(membrane integrity)是精子授精能力的標志,反映精子膜功能狀態(tài)。結(jié)構(gòu)完整和功能活化的質(zhì)膜是精子細胞代謝、獲能頂體反應、附著和穿越卵細胞等生理活動所必需的。使用SYBR14和碘化丙啶(Propidium Iodide;PI)雙重熒光染色,是精子質(zhì)膜完整性分析的最常用的方法。首先使用SYBR14染色,基于其可以自由穿越活體且質(zhì)膜完好的精子細胞,與核內(nèi)核酸結(jié)合的特點,顯示質(zhì)膜完整性。而碘化丙啶受到質(zhì)膜完整的活體精子細胞(包括游動性和非游動性精子)的排斥,而容易進入破損或死亡精子細胞,表明質(zhì)膜損傷。雙染的作用,以幫助區(qū)分質(zhì)膜結(jié)構(gòu)完整性與否。通過常用的熒光顯微鏡,便可清晰觀察到質(zhì)膜狀態(tài)(status)。
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO保存液(Reagent A) 毫升
HEPENGBIO染色液A(Reagent B) 微升
HEPENGBIO染色液B(Reagent C) 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存在-20℃冰箱里;HEPENGBIO染色液A和B(Reagent B和C)避免光照,有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管:用于樣品操作的容器
微型臺式離心機:用于樣品染色操作的容器
血細胞計數(shù)器:用于細胞計數(shù)
載玻片和蓋玻片:用于精子細胞爬片
(共聚焦)熒光顯微鏡:用于觀察染色的精子細胞
實驗步驟
1. 移取新鮮獲得的1毫升精液(48小時內(nèi))到1.5毫升離心管
2. 放進37℃培養(yǎng)箱孵育30分鐘
3. 放進微型臺式離心機離心5分鐘,速度為600g
4. 小心抽去上清液
5. 加入xx毫升HEPENGBIO保存液(Reagent A),混勻顆粒群
6. 在血細胞計數(shù)器上進行精子細胞計數(shù),并調(diào)整到2 X 107精子細胞/毫升
7. 移取100微升精子細胞到新的1.5毫升離心管
8. 加入xx微升HEPENGBIO染色液A(Reagent B),混勻
9. 37℃溫度下孵育10分鐘,避免光照
10. 小心加入xx微升HEPENGBIO染色液B(Reagent E),混勻
11. 37℃溫度下孵育10分鐘,避免光照
12. 移取50微升到載玻片上
13. 小心抽去染色液
14. 蓋上蓋玻片
15. 即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)(注意:每個視野計數(shù)200個精子)
觀察綠色熒光—HEPENGBIO染色液B(Reagent E):濾波器激發(fā)波長490nm,散發(fā)波長520nm
觀察紅色熒光—HEPENGBIO染色液A(Reagent B):濾波器激發(fā)波長:488nm;散發(fā)波長:630nm
16. 分析結(jié)果
注意事項
1. 本產(chǎn)品為20次操作
2. 操作時須戴手套
3. 樣品檢測前,建議在血細胞計數(shù)器上進行精子細胞計數(shù)
4. 精子細胞計數(shù)時乘上稀釋倍數(shù)104。標準血細胞計數(shù)器(Hemocytometer)的計算方法是:
1毫米方塊的細胞計數(shù)X 104(稀釋倍數(shù))=實際細胞數(shù)/毫升
5. 染色完成后,即刻進行檢測分析
6. 本公司提供系列發(fā)育生物學相關(guān)檢測試劑產(chǎn)品
產(chǎn)品內(nèi)容
HEPENGBIO保存液(Reagent A) 毫升
HEPENGBIO染色液A(Reagent B) 微升
HEPENGBIO染色液B(Reagent C) 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存在-20℃冰箱里;HEPENGBIO染色液A和B(Reagent B和C)避免光照,有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管:用于樣品操作的容器
微型臺式離心機:用于樣品染色操作的容器
血細胞計數(shù)器:用于細胞計數(shù)
載玻片和蓋玻片:用于精子細胞爬片
(共聚焦)熒光顯微鏡:用于觀察染色的精子細胞
實驗步驟
1. 移取新鮮獲得的1毫升精液(48小時內(nèi))到1.5毫升離心管
2. 放進37℃培養(yǎng)箱孵育30分鐘
3. 放進微型臺式離心機離心5分鐘,速度為600g
4. 小心抽去上清液
5. 加入xx毫升HEPENGBIO保存液(Reagent A),混勻顆粒群
6. 在血細胞計數(shù)器上進行精子細胞計數(shù),并調(diào)整到2 X 107精子細胞/毫升
7. 移取100微升精子細胞到新的1.5毫升離心管
8. 加入xx微升HEPENGBIO染色液A(Reagent B),混勻
9. 37℃溫度下孵育10分鐘,避免光照
10. 小心加入xx微升HEPENGBIO染色液B(Reagent E),混勻
11. 37℃溫度下孵育10分鐘,避免光照
12. 移取50微升到載玻片上
13. 小心抽去染色液
14. 蓋上蓋玻片
15. 即刻在(共聚焦)熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)(注意:每個視野計數(shù)200個精子)
觀察綠色熒光—HEPENGBIO染色液B(Reagent E):濾波器激發(fā)波長490nm,散發(fā)波長520nm
觀察紅色熒光—HEPENGBIO染色液A(Reagent B):濾波器激發(fā)波長:488nm;散發(fā)波長:630nm
16. 分析結(jié)果
分類 | 染色結(jié)果 | 意義 |
I | 整個精子頭部呈現(xiàn)明亮綠色熒光 | 質(zhì)膜完整(intact) |
II | 整個或部分精子頭部呈現(xiàn)紅色熒光 | 質(zhì)膜完全損傷(damaged) |
III | 整個精子頭部呈現(xiàn)橘黃色熒光 | 質(zhì)膜損傷 |
注意事項
1. 本產(chǎn)品為20次操作
2. 操作時須戴手套
3. 樣品檢測前,建議在血細胞計數(shù)器上進行精子細胞計數(shù)
4. 精子細胞計數(shù)時乘上稀釋倍數(shù)104。標準血細胞計數(shù)器(Hemocytometer)的計算方法是:
1毫米方塊的細胞計數(shù)X 104(稀釋倍數(shù))=實際細胞數(shù)/毫升
5. 染色完成后,即刻進行檢測分析
6. 本公司提供系列發(fā)育生物學相關(guān)檢測試劑產(chǎn)品