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HEPENGBIO革蘭氏陰性細菌外膜囊泡高純制備試劑盒產品說明書
主要用途
HEPENGBIO革蘭氏陰性細菌外膜囊泡高純制備試劑是一種旨在使用差速和等密度離心，高度分離并收集所有細胞外膜囊泡的方法。其制備物產量高，活性保證，純度可達99％。適合于各種革蘭氏陰性細菌外膜囊泡及其蛋白的高質純化。產品即到即用，性能穩定，操作便捷，萃取產量和純度皆佳。
技術背景
外膜囊泡（outer membrane vesicle；OMV）為含有周質內容物（包括外膜蛋白、DNA、RNA、脂多糖、脂質、周質蛋白、黏附素、免疫調節化合物等）的球形電子致密芽狀體（spherical bud），細胞外間隔體，雙層磷脂，20至200納米大小，來自于革蘭氏陰性細菌周邊突起物的釋放形成或胞外分泌產物，使之與環境或宿主細胞進行反應，并調解各種功能，包括促進病理形成，調節細菌互動，轉運各種信號分子（例如DNA、RNA、蛋白質、內毒素、毒力因子等），保護細菌生存、結合和侵入，引起毒性，產生抗生素抗性等。外膜囊泡的產量取決于細菌生長周期、營養條件、溫度、氧化應激狀態等。病原菌的外膜囊泡10倍于非病原菌體。外膜囊泡具有疫苗開發中免疫調節潛力。通過差速離心和等密度離心，獲得高純外膜囊泡，充分保留其蛋白質的免疫和生物學活性。
產品內容
HEPENGBIO保存液（Reagent A） 250毫升
HEPENGBIO高純液A（Reagent B1） 80毫升
HEPENGBIO高純液B（Reagent B2） 80毫升
HEPENGBIO溶解液（Reagent C） 10毫升
HEPENGBIO活性液（Reagent D） 50微升
產品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO活性液（Reagent D）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月
用戶自備
250毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
分光光度儀：用于測定細菌濃度
臺式離心機：用于樣品操作
超速離心機：用于樣品操作
恒溫搖床：用于培養細菌細胞
0.45微米濾膜：用于樣品操作
真空濃縮裝置：用于樣品操作
實驗步驟
實驗開始前，將試劑盒里的HEPENGBIO活性液（Reagent D）從－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO溶解液（Reagent C）到1.5毫升離心管，加入5微升HEPENGBIO活性液（Reagent D），充分混勻，置于冰槽里，標記為HEPENGBIO溶解工作液。然后進行下列操作。
1． 準備好5毫升過夜培養的新鮮細菌樣品
2． 移取2.5毫升到500毫升細菌培養液（注意：用戶可以進行誘導培養，例如無鐵培養等）
3． 放進37℃恒溫搖床孵育過夜，速度為200RPM
4． 在分光光度儀上測OD600為1（1 OD＝1 X 109細胞/毫升）
5． 轉移到預冷的250毫升錐形離心管（注意：用戶可以根據實際情況，使用適宜的離心管）
6． 放進4℃臺式離心機離心30分鐘，速度為5000g
7． 小心移取上清液到新的500毫升容器
8． 重復實驗步驟6和7一次
9． 使用0.45微米濾膜真空過濾一次
10． （選擇步驟）使用100kD蛋白臨界點濃縮處理（例如Millipore centriplus YM100）
11． 放進4℃超速離心機離心3小時，速度為150000g
12． 小心抽去上清液
13． 加入2毫升預冷的HEPENGBIO保存液（Reagent A），充分混勻沉淀顆粒
14． 放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續后續操作
15． 移取4毫升HEPENGBIO高純液A（Reagent B1）到10毫升超速離心管 （注意：用戶根據離心機情況，調整試劑用量）
16． 沿著管壁輕輕加入4毫升HEPENGBIO高純液B（Reagent B2）在HEPENGBIO高純液A（Reagent B1）的上面，避免震動
17． 沿著管壁輕輕加入2毫升囊泡混勻液在HEPENGBIO高純液B（Reagent B2）的上面，避免震動
18． 放進4℃超速離心機離心20小時，速度為200000g
19． 小心取出超速離心管：可見下端（HEPENGBIO高純液A（Reagent B1）和HEPENGBIO高純液B（Reagent B2）交界處附近）白色樣品帶
20． 小心抽去囊泡樣品帶以上的液體
21． 小心收集囊泡樣品帶到10毫升超速離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純外膜囊泡樣品
22． 加入適量HEPENGBIO保存液（Reagent A）至管頂
23． 放進4℃超速離心機離心3小時，速度為150000g
24． 小心抽去上清液
25． 加入500微升HEPENGBIO保存液（Reagent A），混勻
26． 即刻移入到預冷的1.5毫升離心管
27． 放進－70℃冰箱里保存
28． 或加入200微升預冷的含有HEPENGBIO溶解液（Reagent C）和HEPENGBIO活性液（Reagent D）的HEPENGBIO溶解工作液
29． 用槍頭上下抽吸，充分混勻
30． 轉移到新的預冷的1.5毫升離心管
31． 即刻放進－70℃冰箱里保存或置于冰槽里備用
32． 進行后續蛋白定量、熒光定量或電鏡檢測等
33．
注意事項
1． 本產品為20次（500毫升菌液）操作
2． 所有操作須在4℃狀態下進行
3． 建議使用新鮮細菌接種，培養到指數生長階段為理想狀態
4． 使用HEPENGBIO高純液（Reagent B），嚴格注意避免污染母液
5． HEPENGBIO活性液（Reagent D）避免反復凍融
6． 本產品按照500毫升培養菌液配制。如果操作不同菌液容量，可相應調整試劑用量
7． 根據菌種不同，500毫升（OD600＝1）菌液可獲得5至50微克高純外膜囊泡蛋白
8． 制備產物如果放在－70℃冰箱里儲存備用，嚴格避免反復凍融
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HEPENGBIO革蘭氏陰性細菌外膜囊泡高純制備試劑盒產品說明書
主要用途
HEPENGBIO革蘭氏陰性細菌外膜囊泡高純制備試劑是一種旨在使用差速和等密度離心，高度分離并收集所有細胞外膜囊泡的方法。其制備物產量高，活性保證，純度可達99％。適合于各種革蘭氏陰性細菌外膜囊泡及其蛋白的高質純化。產品即到即用，性能穩定，操作便捷，萃取產量和純度皆佳。
技術背景
外膜囊泡（outer membrane vesicle；OMV）為含有周質內容物（包括外膜蛋白、DNA、RNA、脂多糖、脂質、周質蛋白、黏附素、免疫調節化合物等）的球形電子致密芽狀體（spherical bud），細胞外間隔體，雙層磷脂，20至200納米大小，來自于革蘭氏陰性細菌周邊突起物的釋放形成或胞外分泌產物，使之與環境或宿主細胞進行反應，并調解各種功能，包括促進病理形成，調節細菌互動，轉運各種信號分子（例如DNA、RNA、蛋白質、內毒素、毒力因子等），保護細菌生存、結合和侵入，引起毒性，產生抗生素抗性等。外膜囊泡的產量取決于細菌生長周期、營養條件、溫度、氧化應激狀態等。病原菌的外膜囊泡10倍于非病原菌體。外膜囊泡具有疫苗開發中免疫調節潛力。通過差速離心和等密度離心，獲得高純外膜囊泡，充分保留其蛋白質的免疫和生物學活性。
產品內容
HEPENGBIO保存液（Reagent A） 250毫升
HEPENGBIO高純液A（Reagent B1） 80毫升
HEPENGBIO高純液B（Reagent B2） 80毫升
HEPENGBIO溶解液（Reagent C） 10毫升
HEPENGBIO活性液（Reagent D） 50微升
產品說明書 1份
保存方式
保存HEPENGBIO活性液（Reagent D）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月
用戶自備
250毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器
分光光度儀：用于測定細菌濃度
臺式離心機：用于樣品操作
超速離心機：用于樣品操作
恒溫搖床：用于培養細菌細胞
0.45微米濾膜：用于樣品操作
真空濃縮裝置：用于樣品操作
實驗步驟
實驗開始前，將試劑盒里的HEPENGBIO活性液（Reagent D）從－20℃的冰箱里取出，置入冰槽里凍融，然后移出1毫升HEPENGBIO溶解液（Reagent C）到1.5毫升離心管，加入5微升HEPENGBIO活性液（Reagent D），充分混勻，置于冰槽里，標記為HEPENGBIO溶解工作液。然后進行下列操作。
1． 準備好5毫升過夜培養的新鮮細菌樣品
2． 移取2.5毫升到500毫升細菌培養液（注意：用戶可以進行誘導培養，例如無鐵培養等）
3． 放進37℃恒溫搖床孵育過夜，速度為200RPM
4． 在分光光度儀上測OD600為1（1 OD＝1 X 109細胞/毫升）
5． 轉移到預冷的250毫升錐形離心管（注意：用戶可以根據實際情況，使用適宜的離心管）
6． 放進4℃臺式離心機離心30分鐘，速度為5000g
7． 小心移取上清液到新的500毫升容器
8． 重復實驗步驟6和7一次
9． 使用0.45微米濾膜真空過濾一次
10． （選擇步驟）使用100kD蛋白臨界點濃縮處理（例如Millipore centriplus YM100）
11． 放進4℃超速離心機離心3小時，速度為150000g
12． 小心抽去上清液
13． 加入2毫升預冷的HEPENGBIO保存液（Reagent A），充分混勻沉淀顆粒
14． 放進－70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續后續操作
15． 移取4毫升HEPENGBIO高純液A（Reagent B1）到10毫升超速離心管 （注意：用戶根據離心機情況，調整試劑用量）
16． 沿著管壁輕輕加入4毫升HEPENGBIO高純液B（Reagent B2）在HEPENGBIO高純液A（Reagent B1）的上面，避免震動
17． 沿著管壁輕輕加入2毫升囊泡混勻液在HEPENGBIO高純液B（Reagent B2）的上面，避免震動
18． 放進4℃超速離心機離心20小時，速度為200000g
19． 小心取出超速離心管：可見下端（HEPENGBIO高純液A（Reagent B1）和HEPENGBIO高純液B（Reagent B2）交界處附近）白色樣品帶
20． 小心抽去囊泡樣品帶以上的液體
21． 小心收集囊泡樣品帶到10毫升超速離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純外膜囊泡樣品
22． 加入適量HEPENGBIO保存液（Reagent A）至管頂
23． 放進4℃超速離心機離心3小時，速度為150000g
24． 小心抽去上清液
25． 加入500微升HEPENGBIO保存液（Reagent A），混勻
26． 即刻移入到預冷的1.5毫升離心管
27． 放進－70℃冰箱里保存
28． 或加入200微升預冷的含有HEPENGBIO溶解液（Reagent C）和HEPENGBIO活性液（Reagent D）的HEPENGBIO溶解工作液
29． 用槍頭上下抽吸，充分混勻
30． 轉移到新的預冷的1.5毫升離心管
31． 即刻放進－70℃冰箱里保存或置于冰槽里備用
32． 進行后續蛋白定量、熒光定量或電鏡檢測等
33．
注意事項
1． 本產品為20次（500毫升菌液）操作
2． 所有操作須在4℃狀態下進行
3． 建議使用新鮮細菌接種，培養到指數生長階段為理想狀態
4． 使用HEPENGBIO高純液（Reagent B），嚴格注意避免污染母液
5． HEPENGBIO活性液（Reagent D）避免反復凍融
6． 本產品按照500毫升培養菌液配制。如果操作不同菌液容量，可相應調整試劑用量
7． 根據菌種不同，500毫升（OD600＝1）菌液可獲得5至50微克高純外膜囊泡蛋白
8． 制備產物如果放在－70℃冰箱里儲存備用，嚴格避免反復凍融
